Inhaltsverzeichnis

 

1      Das Leben und seine Bestandteile
1.1   Der Aufbau von DNA und RNA 17
1.2   Der genetische Code 20
1.3   Die Gene 22
1.3.1 Die Genstruktur in Prokaryoten 22
1.3.2 Genstruktur in Eukaryoten 24
1.4   Proteine 26
1.5   Die Zelle 302      Grundlagen der Arbeit im Labor
2.1   Wasser 34
2.2   Messung des pH-Werts 35
2.3   Puffer 36
2.4   Waagen 36
2.5   Mikropipetten 38
2.6   Gefäße im Labor 40
2.7   Zentrifugen 41
2.8   Mischen und Konzentrieren 44
2.8.1 Konzentrieren 45
2.8.2 Pufferwechsel 45
2.9   Probenlagerung 46
2.10 Steriles Arbeiten 46
2.11 Ger√§te f√ľr den Aufschluss von Geweben 49
2.12 Pflege und Aufzucht von Escherichia coli 51
2.12.1 Nährmedien 52
2.12.2 Antibiotika 53
2.12.3 Lagerung von Bakterien 55

3      Aufreinigung von Nukleinsäuren
3.1   Gegenspieler erfolgreicher DNA- und RNA-   Isolationen 59
3.1.1 Nukleasen 59
3.1.2 Scherkräfte 60
3.1.3 Chemische Verunreinigungen 60
3.1.4 EDTA und zweiwertige Ionen 61
3.2   Extraktion von Nukleinsäuren 62
3.3   Die weitere Aufreinigung der DNA 64
3.3.1 Phenolextraktion 64
3.3.2 Ethanolfällung 65
3.3.3 Isopropanolfällung 67
3.3.4 PEG-Fällung 68
3.3.5 Entfernen von Polysacchariden mit CTAB 68
3.3.6 Tropfendialyse 68
3.4   Silica Matrices 69
3.4.1 Von Nukleinsäuren und Silica Matrices 69
3.4.2 √úbersicht √ľber den Einsatz von Kits 70
3.5   Ausgewählte DNA Aufreinigungsverfahren 71
3.5.1 Die Plasmidpräparation aus E. coli 71
3.5.2 Die Isolation von DNA aus Pflanzen mit CTAB 72
3.5.3 Isolation von DNA aus Blut oder Zellkulturen 74
3.5.4 Isolation hochmolekularer DNA 75
3.6   Die Isolation von RNA 76
3.7   Tipps zum Erzielen hoher Ausbeuten bei der Isolation von Nukleinsäuren 78
3.8   Quantifizierung von Nukleinsäuren 79
3.8.1 DNA-Bestimmung im Photometer 79
3.8.2 Konzentrationsbestimmung mittels optischer Dichte 81

4      Polymerase- Kettenreaktion
4.1   Prinzip der Polymerase- Kettenreaktion 85
4.2   Die Komponenten der PCR 86
4.2.1 Die Ausgangs-DNA 86
4.2.2 Thermostabile DNA-Polymerasen 86
4.2.3 Puffer, Magnesium und dNTPs 89
4.2.4 Primer 91
4.3 ¬†¬†Ger√§te f√ľr die PCR 93
4.4   Die Standard-PCR 94
4.5   Ausgewählte PCR-Methoden 94
4.5.1 Two-Step PCR 94
4.5.2 Gradienten-PCR und Touch-Down PCR 96
4.5.3 Nested PCR 97
4.5.4 Multiplex PCR 97
4.5.5 Einf√ľhren von Restriktionsschnittstellen 98
4.5.6 Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) 99
4.5.7 Kolonie-PCR 102
4.5.8 Quantitative PCR 103
4.6   Anwendungen der PCR 105
4.7   Optimierung der PCR-Reaktion 105

5¬†¬†¬†¬†¬† Klonieren f√ľr Einsteiger
5.1   Restriktionsenzyme 109
5.1.1 Restriktionsenzyme des Typs II 110
5.1.2 Restriktionsenzyme im Labor 113
5.1.3 Methylasen und Typ IIM-Enzyme 115
5.1.4 Typ IIS-Enzyme 116
5.2   Ligation 116
5.3   (De)Phosphorylierung von DN 118
5.3.1 Dephosphorylierung 118
5.3.2 Phosphorylierung 119
5.4 ¬†¬†Enzyme f√ľr spezielle Aufgaben 121
5.5   Die Transformation von E. coli 121
5.6   Der Weg zum klonierten Gen 123
5.7   Der ungerichtete Einbau einer amplifizierten DNA in einen Vektor 123
5.7.1 Die Klonierung √ľber eine Restriktionsstelle 124
5.7.2 TA-Klonierung und TOPO-Cloning 125
5.7.3 Klonierung in ein Letal-Plasmid 126
5.7.4 Zyklische Blunt End Klonierung 126
5.8   Der gerichtete Einbau von DNA in einen Vektor 127
5.9 ¬†¬†Wenn es mal nicht klappt … 129

6 Vektoren
6.1   Plasmide 132
6.2   Klonierungsplasmide 135
6.2.1 Blau-Weiß-Screening 135
6.2.2 Letalvektoren 138
6.3   Expressionsplasmide 139
6.3.1 Promotoren f√ľr Expressionsvektoren 140
6.3.2 Weitere regulative Sequenzen 141
6.3.3 Expression in das Periplasma 141
6.3.4 Einschlusskörperchen [Inclusion Bodies] 141
6.3.5 Tag-Sequenzen 142
6.4   Reportergene 142
6.5   Phagen 146
6.6   Phagemide 147
6.7   Shuttle-Vektoren 147
6.8 ¬†¬†K√ľnstliche Chromosome: YACs, BACs und PACs 148
6.9   Hefen als Klonierungs- und Expressionssystem 149
6.9.1 Hefe als Modellorganismus 149
6.9.2 Vektoren f√ľr Hefe 151
6.9.3 Transformation von Hefe 152
6.10   Pflanzen als Bioreaktoren 152
6.10.1 Die Transformation von Pflanzen 153
6.10.2 Transiente Transformationsverfahren 155
6.11   Die Transformation von Säugetieren und tierischen Zellkulturen 156
6.11.1 Säugetiere als Modellorganismen 156
6.11.2 Säuger-Zellkulturen 157
6.11.3 Vektoren f√ľr tierische Zellen 158
6.11.4 Transfektion tierischer Zellkulturen 159

7       Elektrophorese und Hybridisierung von Nukleinsäuren
7.1    Agarose-Gelelektrophorese von DNA 162
7.2.   Die Detektion der DNA im Gel 167
7.3   Präparative Agarosegele 169
7.4   Auftrennen von RNA im Agarosegel 170
7.5   Fehlersuche bei Agarose-Gelelektrophorese 170
7.6   Hybridisierung von Nukleinsäuren 171
7.6.1 Southern und Northern Blot 173
7.6.2 Herstellung der Sonde und Hybridisierung 174
7.7   Microarrays 1748      Fortgeschrittene Klonierung
8.1   Klonsammlungen und synthetische Gene 179
8.1.1 Klonsammlungen 180
8.1.2 Synthetische Gene und Genfragmente 180
8.2   Rekombinase-basierte Klonierung 181
8.3   Mutageneseverfahren 183
8.4   PCR-basierte Klonierungsverfahren: RF-Cloning und oePCR 186
8.5   Synthetische Biologie 188
8.6   Biobricks 189
8.7   Nahtlose Klonierungsverfahren 189
8.7.1 Golden Gate Klonierung 190
8.7.2 Cut-Ligation Verfahren 191
8.7.3 Multiple Insertionen mittels Golden Gate Klonierung 192
8.7.4 Golden Gate basierte Tool Kits am Beispiel des MoClo Kits 192
8.8   Gibson Assembly 195
8.9   Vergleich der Verfahren 198

9      Proteinaufreinigung
9.1   Homogenisation 203
9.1.1 Proteasen 204
9.1.2 Phenoloxidasen 206
9.2   Extraktion von Proteinen 207
9.2.1 Homogenisationspuffer 207
9.2.2 Abtrennen von Zell- und Gewebetr√ľmmern 208
9.2.3 Fraktionierung des Rohextrakts 208
9.3   Dialyse und Konzentrierung 211
9.4   Weitere Aufreinigungsschritte 212
9.4.1 Chromatographie 213
9.4.2 Chromatographische Trennprinzipien 215
9.4.3 Magnetic Beads 216
9.5   Quantifizierung von Proteinen 217
9.5.1 Proteinbestimmung nach Bradford 217
9.5.2 BCA-Test 219
9.5.3 Welchen Test benutzen? 220
9.6 ¬†¬†Aufreinigungsverfahren f√ľr getaggte Proteine aus E. coli 221
9.6.1 Bakterienanzucht und Homogenisation 222
9.6.2 Weitere Aufreinigung des heterologen Proteins 224

10      Gelelektrophorese von Proteinen
10.1   Die Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) 229
10.2   Die denaturierende SDS-PAGE 229
10.2.1 Herstellung eines Proteinextrakts f√ľr die SDS-Gelelektrophorese 229
10.2.2 Herstellen des Gels 232
10.2.3 Der Gellauf 235
10.3   Das Färben der Gele 237
10.4 ¬†¬†Weitere Elektrophoreseverfahren f√ľr Proteine 239
10.4.1 Native PAGE 239
10.4.2 Isoelektrische Fokussierung 239
10.4.3 2-D-Gelelektrophorese 239
10.5   Western Blotting 241
10.6   MassenspektrometrischeVerfahren 246

11      Immunbiochemische Methoden
11.1   Antikörper 251
11.2   Prinzipien immunbiochemischer Verfahren 254
11.2.1 Immunpräzipitation 254
11.2.2 Trägerbasierte Immunfärbung 256
11.2.3 Immobilisierung des Antigens 257
11.2.4 Blocken √ľbersch√ľssiger Bindestellen 257
11.2.5 Detektion der Bindung 257
11.2.6 Antikörper-Kaskaden 259
11.2.7 Spezifische und unspezifische Bindungen 260
11.3   ELISA 261
11.3.1 Sandwich-ELISA 263
11.3.2 Kompetitiver ELISA 265
11.4   Immunfärbung nach Western Blot 266
11.5   Immunaffinitätschromatographie 269
11.6   Weitere Antikörperbasierte Methoden 270
11.6.1 Rekombinante Antikörper 270
11.6.2 Phage Display und scFv 271
11.6.3 Immunhistochemische Verfahren 273
11.6.4 Markierung von Zellen 274

12      Fortgeschrittene Verfahren
12.1   DNA-Sequenzierung 278
12.1.1 Sequenzierung nach Sanger 278
12.1.2 Herstellen von Proben f√ľr die DNA-Sequenzierung 280
12.2   Next Generation Sequenzierung 281
12.3¬†¬† Von den ‚ÄěOmics‚Äú zur Systembiologie 285
12.4   Analyse der Genfunktion 286
12.4.1 Reverse Genetik und Gene Targeting 286
12.4.2 RNAi 287
12.4.3 Durchf√ľhrung von siRNA-Experimenten 288
12.5   Genom Editierung 289

13      Bioinformatik
13.1   Datenbanken 296
13.2   Dateiformate 298
13.3   Sequenzsuche anhand von Stichwörtern (Entrez) 300
13.4   Sequenzsuche mit einer Sequenz (BLAST) 300
13.5   Bioinformatik zur Planung der Laborarbeit 305

14     Anhang
A1    Sicherheit im Labor 308
A2    Die 10 goldenen Laborregeln 309
A3    Das Laborbuch und die finale Arbeit 311